En contra de los anhelos paternos, Galileo se interesa intensamente en las enseñanzas que recibe de Filippo Fantoni, titular de la cátedra de Matemáticas en dicha universidad; enseñanzas que absorben por entero sus estudios durante sus vacaciones en Florencia. Por lo demás, los cursos que impartiera Ostilio Ricci entre 1582 y 1583 sobre los "Elementos" de Euclides, decantan por entero la vocación de Galileo, y, en 1585, abandona sus estudios de medicina sin completar su graduación, centrándose por completo en el estudio de los textos de Euclides y Arquímides, que Ricci había heredado de su mentor Tartaglia, traductor de numerosos tratados grecolatinos.

Comparece  por primera vez la tenacidad del pisano, que insiste con denuedo en afianzar su empeño, enfrentando las reticencias y recelos paternos. Ya en 1585-86 se encuentra enseñando matemáticas en Siena, donde escribe su primer libro "La Balancitta", sobre las propiedades y fundamentos de las balanzas. Tras su primer viaje a Roma, donde visita a Clavius, profesor del Colegio Romano de los jesuitas, consigue una plaza en Bolonia (en buena medida por intersección del erudito romano). A partir de entonces, Clavius y Guidobaldo del Monte se convierten en sus mentores, confidentes y amigos, con quienes intercambia numerosa correspondencia y debate sobre sus hallazgos sobre el cálculo del centro de gravedad de los cuerpos. La actividad de Galileo en estos años es frenética, ocupando varios puestos de prestigio en las universidades toscanas y vénetas. En 1589, enseña en Pisa, sucediendo a Fantoni en la cátedra de Matemáticas. Durante su estancia en la ciudad toscana escribe "De Motu", conjunto de ensayos sobre la teoría del movimiento, que nunca llegó a publicar. Sin embargo, los avatares familiares ensombrecen la progresión del inicio de su carrera. En 1591 muere su padre, y Galileo con su sueldo de 60 escudos anuales debe afrontar el sustento de su familia; y, en particular, se ve instado a sufragar los dispendios de las dotes matrimoniales de sus dos hermanas.

Galileo recurre a Del monte, quien lo propone como profesor en la universidad de Padua, en los dominios de la República independiente de Venecia, cobrando un salario tres veces superior del que percibía en Pisa (320 florines anuales). En Padua, transcurre los dieciocho mejores años de su vida, en un ambiente alejado de la férrea censura pontificia, como instructor en la Universidad que años antes acogiera como alumno a Copérnico y ajeno a las penurias económicas precedentes. De nuevo le sonríe la vida y entabla una relación estable con Maria Gamba, con quien no llegaría a formalizar matrimonio, aunque contaron con descendencia: Virginia, nacida en 1600; Livia, en 1601 y Vincenzo en 1606. En esta época Galileo reconoce haber cometido un error relativo a su concepción de la entidad de la gravedad, tras consultar a Paolo Sarpi, matemático asesor del gobierno veneciano, se esfuerza en enmendar el contenido vertido en "De motu...", y comienza a trabajar en 1604 en el movimiento de los cuerpos que se deslizan por planos inclinados y en la ley del péndulo.

De 1609 data la construcción de su telescopio, que irá perfeccionando con perseverancia, basándose en la concordancia de dos lentes de concavidades contrapuestas. Sus observaciones con estos instrumentos (réplicas mejoradas del ideado por Thomas Harriot) le permite obtener numeroso resultados, desconocidos en esos años. En particular, descubre las irregularidades de la Luna, intuye y demuestra la presencia de satélites en Júpiter y anillos en Saturno, consigue explicar las fases de Venus y la composición estelar de la Vía Láctea, apunta la existencia del movimiento de libración selénico, etc.; un cúmulo de novedosos aspectos astronómicos, que, en parte, recopiló en 1610 en "El Mensajero de las estrellas", y que fuera completando en aportaciones posteriores.

El éxito alcanzado por "El Mensajero..." incrementó el prestigio del pisano, que, en junio de 1610, le lleva a ocupar el máximo rango de profesor en la Universidad de Pisa y a encargarse personalmente del cargo de "Matemático y Filósofo" personal del Gran Duque de Toscana: Cosme II de Médicis. Viaja a Roma en 1611, donde se le recibe con todo tipo de honores, encumbrado por los astrónomos pontificios, y, en particular, por el papa Pablo IV, que no le permite arrodillarse ante su presencia. También se interesa por él el gran defensor de la contrareforma, el cardenal Belarmino, quien solicita de Clavius un informe detallado de los hallazgos galileanos.

Sigue trabajando intensamente, publicando textos sobre los eclipses: "Cartas sobre los eclipses", de 1613; en relación a la diversidad entre los conceptos de forma, volumen y peso de los cuerpos flotantes: "Discurso sobre las cosas que flotan en el agua o que en ella se desplazan", de 1612; y sobre la física y la astronomía aristotélicas, en "Cartas a la Gran Duquesa", de 1616, remitidas a Cristina de Lorena, auténtica dirigente del estado de Toscana. No obstante, esta actividad frenética, el caudal de reconocimientos que va atesorando y su carácter irascible, pasional, propenso a descalificar a sus oponentes con saña (como ocurriera durante la experimentación sobre la flotación del hielo en el agua ante Cosme II, burlándose de su colega Ludovico Delle Combe); le grajea no pocas enemistades, celosas de sus éxitos y prestas a denunciar cualquiera de sus afirmaciones que se mostraran en contra de la teoría aristotélica, doctrina oficial de la Curia Romana. Recelos que se ven incrementados por su empeño arriesgado en defensa de la visión copernicana del Cosmos, que refrenda en las cartas a Cristina de Lorena, en alegato a favor de un apasionado discurso que pronunciara su pupilo Castelli en la plaza central de la ciudad toscana. Escribe a la gran Duquesa:

"Mantengo que el Sol está localizado en el centro de las revoluciones de las órbitas y no cambia de lugar y que la Tierra rota sobre sí misma y alrededor de él..."

Ya desde 1597, en carta remitida a Johannes Kepler, profesor en Gratz, Galileo abundaba en la idea del heliocentrismo, de la cual también hizo partícipe a Clavius. Clavius, antiguo protector del pisano, se mofa de sus convicciones; mientras que en Europa numerosos científico se adhieren con fervor a sus razones. Destacan, entre otros Marino Mersenne, quien llegó a escribir "¡Galileo! ¿Quién será capaz de enumerar sus descubrimientos? Tan sólo con su telescopio casi ha descubierto más cosa que las hasta ahora conocidas"; Cavalieri, que se consideró a sí mismo discípulo de Galileo, tras conocerlo por intervención del cardenal Borromeo, con quien mantuvo contacto durante largo tiempo buscando, en especial, la aprobación del toscano de la teoría de sus Indivisibles, y quien recibiera su reconocimiento cuando puntualizó: "...pocos, si no nadie, desde Arquímides ha avanzado tan lejos y con tanta profundidad en la ciencia de la Geometría"; o Torricelli, quien a través de Castelli contacta con Galileo en busca de asesoramiento en sus trabajos sobre Matemáticas y Astronomía. Tras el proceso en contra de este último, Torricelli centra su atención en el movimiento parabólico de los proyectiles, mas, no abandona a su maestro y se ofrece como ayudante en la última etapa de su vida en Arcetri y con él comparte los últimos meses de 1641.